PCR (polimerazna verižna reakcija). Kako je PCR diagnozo, indikacije, kako se pripraviti za študijo, rezultati PCR

Za ustrezno in učinkovito zdravljenje številnih nalezljivih bolezni mora biti pravočasno vzpostaviti natančno diagnozo. Pri reševanju tega problema danes sodeluje visokotehnoloških diagnostične metode, ki temeljijo na metodah molekularne biologije. V tem trenutku je verižne reakcije s polimerazo (PCR) že pogosto uporablja v medicinski praksi kot najbolj zanesljivo orodje za laboratorijsko diagnostiko.

Kaj predstavlja priljubljenost PCR v tem trenutku?

Najprej je metoda za detekcijo patogenov različnih infekcijskih bolezni z visoko natančnostjo.

Drugič, za spremljanje učinkovitosti zdravljenja.

V različnih priročnikov, brošur, člankov in razlage zdravnikov specialistov, smo pogosto soočeni z uporabo prikritih izrazov in besed. Dejansko je težko govoriti o visokotehnoloških izdelkov znanosti običajnih besed.

Kaj je bistvo in mehanika diagnostično PCR?

Vsak živi organizem ima svoje edinstvene gene. Gene so razporejeni v molekuli DNA, ki je pravzaprav "kartica" vsakega posebnega organizma. DNK (genetski material) - zelo dolga molekula, ki je sestavljena iz "opeka" imenovanih nukleotidi. Vsaka Vzbujevalnik ležijo natančno določene nalezljive bolezni, to je v določenem zaporedju in kombinaciji. Kadar je treba razumeti, ali ima oseba določeno patogen, vzpenja biološkega materiala (kri, urin, slina, brisov), ki obsega DNA ali DNA fragmente mikroba. Toda količina genskega materiala patogena je zelo majhna in je nemogoče reči, kaj točno mikroorganizem je lastnik. Za rešitev tega problema in služi kot PCR. Bistvo verižne reakcije s polimerazo, da se majhna količina materiala, vzetega za preiskavo, ki obsega DNA, in da PCR postopek je povečanje števila genetskega materiala, ki pripada določeni patogen, zato je mogoče identificirati.

PCR diagnostika - genetska študija biomateriala.

Ideja PCR pripada ameriški znanstvenik K.Mullins, ki jih je predlagal leta 1983. Vendar pa je razširjena klinična uporaba prejela le v sredini 90-ih XXveka.

Bomo razumeli terminologijo, ki je bilo - DNK, itd Vsaka celica vsakega živega bitja (živali, rastlin, človek, bakterij, virusov) ima kromosom. Kromosomi - rejci ta genetski podatki, ki sestavljajo celotno zaporedje genov vsakega posameznega živo bitje.

Vsak kromosom je sestavljen iz dveh sklopov DNA, zavite v spiralo z ozirom drug na drugega. DNK - deoksiribonukleinska kislina je kemijsko, ki so sestavljeni iz strukturnih elementov - nukleotidov. 5 je vrsta nukleotidna - timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C) in uracil (U). Nukleotidi so razporejeni drug za drugim v strogem zaporedju posameznih tvorijo genov. Gen je lahko sestavljen iz 20-200 nukleotidov teh. Na primer, gen, ki kodira za pripravo insulina, sestavljen iz 60 bp.

Nukleotidi so last dopolnjevanja. To pomeni, da je nasprotna adenin (A) v eno verigo DNA potreben timin (T) pri drugi verigi, in nasproti gvanin (G) - citozin (C). Shematsko kot sledi:
D - D
T je: -
A - T
Ta ključna lastnost dopolnjevanja za PCR.

Razen DNA enaka struktura RNA - Ribonukleinska kislina, ki se razlikuje od DNA po tem, da namesto timina se uracila pri tem uporablja. RNK - genetska informacija je skrbnik nekateri virusi, imenovana retrovirusi (na primer HIV).

       DNA in RNA molekule so lahko "večkrat" (to lastnost se uporablja za PCR). To se zgodi, kot sledi: obe verigi DNA ali RNA, odstopajo od vsakega nasprotni strani, vsaka nit dobi posebno encim, ki sintetizira novo verigo. Sinteza je načelo dopolnjevanja, tj, če v prvotni verige DNA vredno nukleotidov A, nato pa na novo sintetiziran bo T, če T - potem C itd Ta poseben encim "builder" potrebuje "seme" za začetek sinteze - zaporedjem nukleotidov 5-15. Ta "seme" je definirano za vsak gen (gen klamidije, mikoplazme virusi) eksperimentalno.

Tako vsaka PCR cikla je sestavljen iz treh korakov. Prvi korak pojavi tako imenovani odvijanje DNK - da se med seboj povezani ločitev dveh DNK verig. V drugem - je "seme", povezava na spletno stran DNK verig. Končno, podatkovne podaljšanje niti DNK, ki je narejen fermentom- "graditelj". Trenutno se ta kompleksen proces v enem cevi in ​​je sestavljena iz ponavljajočih se ciklih razmnoževanja definirano DNA za proizvodnjo velikega števila kopij, ki jih lahko naknadno odkrite po običajnih metodah. To je eden od DNK verig smo dobili več sto ali tisoč.

Faze študij PCR

Vzorčenje biološkega materiala za raziskave

Ker je vzorec drug biološki material, krvi in ​​komponent, urin, slina, sluznice izločke, cerebrospinalna tekočina izločki ran površine, vsebino telesnih votlin. Vsi biološki testi zbrani instrumente za enkratno uporabo in odhodnih materiala zaprti v sterilno plastično epruveto ali položimo na gojitvenem mediju s kasnejšo prevozom v laboratorij.

Odvzetega vzorca dodamo potrebne reagente in čaka na programski termostat - termostat (toplotna ciklerja). Termocikler PCR ponovi 30-50 krat cikla sestavljena iz treh faz (denaturacija, žarjenje in raztezka). Kaj to pomeni? Razmislite podrobnosti.

Faze zlorabili PCR reakcija, prepisovanja genskega materiala

I stopnja PCR - Priprava za kopiranje genskega materiala.
Poteka pri temperaturi od 95 ° C, se prameni DNA ločimo in lahko sedi "primerjem".

"Primerji" se proizvaja industrijskih metod različnih znanstvenih in industrijskih združenj in laboratoriji kupiti ready-made. "Visoka" za identifikacijo, kot so klamidija, deluje samo za klamidijo, itd Torej, če je biološki material testira glede prisotnosti klamidioza, nato reakcijsko zmes postavljeni "seme" za hlamidiy- če testiranje Biološki material za virus Epstein-Barr, in "seme" za virus Epstein-Barr.

II faza - Zveza genskega materiala infekcijskega agensa in "seme."
Če je DNA definiran z virusom ali bakterijam, "seme" sedi na DNA. Proces spajanja "seme" je druga faza PCR. Ta korak poteka pri temperaturi 75 ° C.

III faza - kopija genskega materiala infekcijskega agensa.
Ta postopek dejansko raztezek ali razmnoževanje genskega materiala, ki se pojavlja pri 72 ° C. Z izrazom "seme" je primeren encim "builder" in sintetizira novo vijačnica DNA. S koncem sintezo novih koncev DNA verige in ciklu PCR. To pomeni, da je ena številka PCR cikla poveča genskega materiala dvakrat. Na primer, v originalnem vzorcu imela 100 DNA molekule katerikoli virus, potem bo prva PCR cikla v vzorcu DNA-molekule za preskusni virusa 200. Cikel traja 2-3 minute.

Za tvorbo zadostno količino genetskega materiala za ugotavljanje, smo izvedli na splošno 30-50 ciklov PCR, ki traja 2-3 ure.

Stopnja Identifikacija razmnoženi genetski material

Pravzaprav PCR konča tu in nadalje ni nič manj pomembna faza identifikacije. Za identifikacijo z metodo elektroforeze ali z oznako "primer". Kadar se uporabljajo elektroforeza pridobljeni verige DNK ločimo po velikosti in prisotnost fragmentov DNA različnih dolžin, ki kaže na pozitivni rezultat analize (tj prisotnost virusa, bakterije, itd). Pri uporabi oznako »seme« Doda kromogen (barvila) v končni reakcijski produkt, pri čemer je encimska reakcija, ki jo spremlja tvorba barve. Barva razvoj je neposreden dokaz, da so virus ali druga zaznati sredstvo prisotni v izvirnem vzorcu.

Do danes, z oznako "premaz", kot tudi ustrezno programsko opremo, je mogoče proizvajati na enkrat in "se glasi" rezultate PCR. To je tako nazyvaemayareal-PCR v realnem času.

Zakaj PCR diagnostiko ima to vrednost?

Ena izmed pomembnih prednosti metode PCR je visoka občutljivost - 95 do 100%. Vendar pa je treba te dajatve temeljijo na vedno pod naslednjimi pogoji:

1. Pravilna vzorčenja, transporta biološkega materiala;
2. Razpoložljivost sterilnih enkratno uporabo instrumentov, specializiranih laboratorijih in usposobljenega osebja;
3. strogo upoštevanjem sterilnih tehnik in med analizo

Občutljivost različna za različne bakterije odkrite. Na primer, občutljivost metode PCR za odkrivanje virusa hepatitisa C je 97-98%, občutljivost za odkrivanje Ureaplasma - 99-100%.

Možnosti, ki jih v analizi PCR, lahko dosežejo neprimerljivo analitične specifičnosti. To pomeni identifikacijo mikroorganizma je, da je videti, niso podobni ali tesno povezane.
Diagnostična občutljivost in specifičnost metode PCR, pogosto presegajo tiste pri metodi kulture, ki se imenuje "zlati standard" za odkrivanje nalezljivih bolezni. Glede na trajanje rastoče kulture (od nekaj dni do nekaj tednov), prednost PCR je očitna.

PCR v diagnostiki okužb
Prednosti metode PCR (občutljivost in specifičnost) opredeliti širok spekter uporabe v sodobni medicini.
Glavne aplikacije PCR diagnostiko:

1. Diagnozo akutnih in kroničnih infekcijskih bolezni različnih lokalizacije
2. spremljanje učinkovitosti terapije
3. pojasnitev vrsto patogena

PCR se uporablja v porodništvu, ginekologiji in neonatology in pediatriji, urologiji, venerologija, nefrologijo, infekcijska kliniki bolezen, oftalmologije nevrologiji, Phthisiopneumology et al.

PCR diagnostika izvedemo v povezavi z drugimi raziskovalnih metod (ELISA, PID, AOR et al.). Njihova kombinacija in ugotovi primernost za lečečega zdravnika.

infekcijam z metodo PCR odkrite

virusi:

1. Retrovirusi HIV-1 in HIV-2
2. herpetiformis virusi
3. vrste virus herpes simpleks 1 in 2
4. citomegalovirus
5. Virus Epstein-Barr
6. Varicella - virus zoster
7. humanih herpes virusov 6 in 7
8. hepatitisa C, B in A
9. Virusi, humani papiloma
10. virus rdečk
11. adenovirusi
12. rinovirusi
13. parvovirus
14. pikornovirusy

bakterije:

1. mikobakterije
2. klamidija
3. mycoplasma
4. salmonela
5. Legionella
6. klostridije
7. bledo Treponema
8. Različne vrste patogene E. coli
9. Vibrio cholerae
10. rikecija
11. aurococcus
12.  povzročitelj bakterijskega meningitisa
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. gonoreja
16. davica bacillus
17. Haemophilus influenzae

Na tem seznamu so najpogostejše infekcijam s PCR odkrite. V bistvu, ta seznam je veliko širši, nenehno posodablja, saj sintetizira novo "seme." Prav tako je treba opozoriti, da je seznam ugotovljenih patogenov določa prisotnost "semen" za identifikacijo v arzenalu vsakega posameznega laboratorija.


Avtor: AK Nasedkina